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«PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (ÁREA: MICROBIOLOGIA APLICADA) FUNGOS NEGROS DERIVADOS DE Atta spp.: DIVERSIDADE E FATORES DE ...»

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

(ÁREA: MICROBIOLOGIA APLICADA)

FUNGOS NEGROS DERIVADOS DE Atta spp.:

DIVERSIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA

ANA PAULA MIRANDA DUARTE

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Área: Microbiologia Aplicada).

Rio Claro 2013

ANA PAULA MIRANDA DUARTE

FUNGOS NEGROS DERIVADOS DE Atta spp.:

DIVERSIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Área: Microbiologia Aplicada).

Orientador: Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca Co-orientadora: Profa. Dra. Derlene Attili de Angelis Rio Claro 2013

595.796 Duarte, Ana Paula Miranda D812fu Fungos negros derivados de Atta spp.: diversidade e fatores de virulência / Ana Paula Miranda Duarte. - Rio Claro : [s.n.], 2013 87 f. : il., figs., tabs., quadros Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Fernando Carlos Pagnocca Coorientador: Derlene Attili de Angelis

1. Formiga. 2. Fungos negros isolados. 3.

Formigas-cortadeiras. 4. Fungos melanizados. 5. Oportunista.

6. Exophiala. I. Título.

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP Ao Santo Expedito, das causas justas e urgentes, pelo pedido atendido.

Dedico, À minha família, pelo apoio incondicional.

Ofereço, Agradecimentos À minha família pelo incentivo para que eu concluísse esta dissertação, pelo apoio às minhas decisões e pelos sonhos que vocês deixaram para trás para que eu pudesse realizar o meu.

À Profa. Dra. Derlene Attili de Angelis, pela orientação e conselhos durante o desenvolvimento deste trabalho. Agradeço também a oportunidade que me concedeu de ir ao CBS, na Holanda.

Ao Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca, pela orientação, amizade e incentivo durante esses anos. Também foi de suma importância a disponibilização do laboratório e materiais utilizados.

Ao Dr. Sybren de Hoog, por ter me recebido de forma muito receptiva no CBS, pela orientação e conhecimento compartilhado.

Às pessoas que me ajudaram de diversas formas na viagem à Holanda: Prof. Dr.

Odair Correa Bueno, Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis e a Pró-Reitoria de Pesquisa, na pessoa da Dra. Maria José Soares Mendes Giannini.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área: Microbiologia Aplicada) da UNESP – Rio Claro, na pessoa dos coordenadores Prof. Fernando Carlos Pagnocca e Profa. Sandra M. M. Franchetti.

À Dra. Marcia de Souza Carvalho Melhem e todo o pessoal do Instituto Adolfo Lutz (Rio Claro-SP), pela parceria, profissionalismo e excelente trabalho produzido.

Ao pessoal do Laboratório de Microbiologia do CEIS (antigos e novos): Fábio, Paula, Tati, Thais, Aline Cruz, Aline Castanha, Noemi, Silvio, Ife, Virgínia, Francisco, Samuel, Weilan, Lucas, Lídia e tantas outras pessoas que passaram por lá e de alguma forma me ajudaram a concluir esta dissertação.

À todo o pessoal do CEIS, principalmente à Necis, por toda a atenção e presteza, e ao Zanão, pela disponibilidade em me ajudar e ensinar sobre os tampões.

À minha querida amiga Virgínia, pela amizade que construímos nesses anos e companheirismo. Agradeço também por toda a ajuda no laboratório!

À todos que me acolheram no CBS e auxiliaram nos experimentos: Bert, Anne, Kasper, Kittipan, Sara, Somayeh, Peiying, entre outros. Um agradecimento especial à Renata Gomes, Fred Carranca, Anderson Rodrigues e Sandra Videira, por me proporcionarem um ambiente descontraído e extremamente amigável nesse período de saudades do Brasil.

À família Post (Maartje, Henk, Rick e Ruben), pela hospitalidade, cuidados, amizade e dedicação. Definitivamente foram vocês que me ajudaram a passar por muitos obstáculos e dificuldades durante a minha estadia na Holanda.

Ao Gouveia, primeiramente pelo excelente professor de inglês que é. Obrigada também pela amizade, conselhos e correção dessa dissertação. Meus agradecimentos à Júlia e Henrique pela receptividade.

Ao Nilson Satoru Nagamoto e Prof. Luiz Carlos Forti do Laboratório de Insetos Sociais-Pragas (UNESP – Botucatu) pelas coletas das formigas utilizadas.

À todas as pessoas não mencionadas neste curto espaço mas que contribuíram para meu desenvolvimento científico e pessoal.

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As formigas da tribo Attini são conhecidas como “cultivadoras de fungos” devido à complexa simbiose que mantém com um fungo basidiomiceto, cultivado como alimento.

Além do fungo mutualista, cresce continuamente a lista de micro-organismos encontrados nos ninhos e na cutícula desses insetos. Recentemente, leveduras negras, relacionadas ao gênero Phialophora, foram consideradas componentes da simbiose formiga-fungo por comprometerem a habilidade das formigas em lidar com o micoparasita Escovopsis. Os fungos melanizados estão frequentemente relacionados a infecções humanas e, por isso, tem sido questionada a possibilidade desses insetos atuarem como vetores de dispersão de fungos negros patógenos no ambiente urbano. Esta dissertação marca o início de um esforço no qual procuramos investigar a diversidade de fungos negros presentes na cutícula de formigas cortadeiras, bem como verificar o grau de virulência das estirpes obtidas. Este último aspecto, ou seja, a possibilidade das formigas cortadeiras abrigarem e dispersarem micro-organismos patogênicos pode ser o início de um novo ramo de investigação. Analisando fêmeas aladas (içás) de Atta capiguara e A. laevigata, coletadas antes do início do voo nupcial, verificou-se que elas abrigam em suas cutículas uma comunidade diversa de fungos negros, como os gêneros Cladophialophora, Cladosporium, Cochliobolus, Exophiala, Ochroconis, Phaeococcomyces, Phialophora, Penidiella e Pyrenochaeta. Num segundo estudo, os resultados indicaram que leveduras negras do gênero Exophiala, presentes na cutícula de içás e em ambientes contaminados por derivados de petróleo, apresentam características que as tornam potenciais oportunistas humanos, como consistente crescimento a 40°C e produção de lacases. Espera-se que os resultados deste trabalho possam servir de ponto de partida para estudos mais detalhados visando examinar de que forma esses fungos chegam ao interior dos ninhos, como eles sobrevivem e se relacionam com os insetos, e, também, verificar se são propagados a partir desse ambiente.





Palavras chave: fungos melanizados, oportunista, Exophiala, formigas-cortadeiras.

ABSTRACT

Attini ants are known as fungus-growing ants due to a complex symbiosis with a basidiomycete fungus cultivated as a food source. Besides the mutualistic fungus, there is a continuous growth in the list of microorganisms found in nests and cuticles of these insects.

Phialophora-related black yeasts have recently been considered as components of the antfungus symbiosis by compromising the ability of ants to deal with the mycoparasite Escovopsis. Melanized fungi are frequently related to human infections and, therefore, the ability of these insects act as vectors for dispersal of pathogenic black fungi in the urban environment has been questioned. This dissertation makes a start at assessing the diversity of black fungi derived from the cuticle of leaf-cutting ants, as well as verifying the virulence degree of the strains obtained. The latter, i.e., the possibility of ants sheltering and dispersing pathogenic microorganisms can be the start of a new research field. Our microbial profile of Atta capiguara and A. laevigata winged females, collected prior to the mating flight, revealed that the cuticle of ants can harbor a diverse community of black fungi, such as the melanized genera Cladophialophora, Cladosporium, Cochliobolus, Exophiala, Ochroconis, Phaeococcomyces, Phialophora, Penidiella and Pyrenochaeta. Moreover, we demonstrated that Exophiala species, associated with gynes’ cuticle and hydrocarbon-polluted environments, have characteristics that make them potential human opportunists, like consistent growth at 40°C and laccase production. Our results will certainly serve as a basis for more detailed future studies to explore how these fungi reach the interior of the nest, how they survive and relate to insects, as well as check whether the fungi are propagated from this environment.

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INTRODUÇÃO

1 Formigas cortadeiras (Tribo Attini)

2 Comunidade microbiana associada às formigas Attini

3 Componentes cuticulares em formigas cortadeiras

4 Os fungos como biodegradadores

5 Fungos negros: características e fatores de virulência

5.1 Produção de exopolissacarídeos

5.2 Termotolerância

5.3 Produção de lacases

5.4 Diversidade molecular: classificação em genótipos

6 Referências Bibliográficas

CAPÍTULO 1 - Leaf-cutting ants: an environmental niche accommodating human opportunistic black fungi

CAPÍTULO 2 - Molecular diversity and virulence factors in Exophiala species from environmental samples

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1 Formigas-cortadeiras (Tribo Attini) As formigas da tribo Attini (Hymenoptera: Formicidae), encontradas exclusivamente nas Américas (WEBER, 1972; MAYHÉ-NUNES; JAFFÉ, 1998; MEHDIABADI;

SCHULTZ, 2009), estão envolvidas em um antigo e obrigatório mutualismo com fungos basidiomicetos do gênero Leucoagaricus (CHAPELA et al., 1994), cultivados como alimento (MUELLER; RABELING, 2008; SCHULTZ; BRADY, 2008).

A fungicultura das formigas Attini originou-se há aproximadamente 60-50 milhões de anos (SCHULTZ; BRADY, 2008) e desde então tem experimentado uma série de modificações evolutivas de modo que as formigas e os fungos não podem mais sobreviver isoladamente.

Embora todas as formigas Attini sejam conhecidas como cultivadoras de fungos, os dois gêneros mais derivados filogeneticamente (CURRIE, 2001), Acromyrmex e Atta, são mais comumente conhecidos como formigas-cortadeiras por possuírem o hábito de cortar elevadas quantidades de material vegetal (MARICONI, 1970), utilizadas como substrato para o crescimento do fungo simbionte (WEBER, 1972). Uma vez no interior do ninho, o substrato vegetal é processado e incorporado no “jardim de fungos”, estrutura de coloração esbranquiçada constituída pelo micélio do fungo simbionte e material vegetal coletado.

Apesar de serem consideradas herbívoros generalistas, algumas espécies de formigas-cortadeiras se especializaram em cortar gramíneas, outras, dicotiledôneas, podendo também coletar flores e frutos (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990; BEATTIE; HUGHES, 2003). A Quadro 1 apresenta as principais diferenças entre as duas espécies amostradas no presente estudo, Atta capiguara e A. laevigata.

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Material vegetal Preferencialmente Mono- e dicotiledôneas, JUSTI et al., 1996; VASCONCELOS;

coletado monocotiledôneas preferência por folhas secas CHERRETT, 1996; FORTI; BOARETTO, 1997 As formigas, por sua vez, fornecem ao fungo um ambiente favorável ao crescimento e protegem-no de diversos contaminantes e competidores (CHERRETT et al., 1980;

WETTERER, 1994). Dentre as estratégias utilizadas pelas formigas para impedir ou diminuir o desenvolvimento de micro-organismos parasitas destacam-se: 1. Limpeza do substrato vegetal coletado, eliminando mecanicamente esporos fúngicos contaminantes e outros microorganismos (CURRIE; STUART, 2001; VAN BAEL et al., 2009); 2. Uso de secreções glandulares com propriedades antissépticas (MARSARO-JÚNIOR et al., 2001;

FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2006); 3. Remoção de partes infectadas dos jardins de fungo (CURRIE; STUART, 2001); e, 4. Interações com outros micro-organismos capazes de proteger os ninhos (CURRIE et al., 1999b). Além disso, esses insetos também promovem a dispersão do fungo mutualista para novas colônias através de um inóculo inicial levado na cavidade infrabucal de fêmeas aladas (içás) durante o período de reprodução, chamado de revoada (MUELLER, 2002).

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permanecem um curto período na superfície do solo e levantam voo, acasalando em pleno ar.

Depois do acasalamento, as futuras rainhas dos formigueiros retornam ao solo para estabelecerem novas colônias.

2 Comunidade microbiana associada às formigas Attini Historicamente, os jardins de fungos foram descritos como monoculturas puras, nas quais as formigas excluíam micro-organismos contaminantes (MÖLLER, 1893). Essa visão permaneceu por muito tempo, mas relatos da presença de outros micro-organismos nos jardins de fungos e exoesqueleto de formigas-cortadeiras foram publicados (PAGNOCCA et al., 2011, 2012).

Um século após a primeira descrição do fungo mutualista, Currie et al. (1999a) estabeleceram que os jardins também abrigam fungos parasitas especializados do gênero Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales). Encontrado apenas em associação com colônias de formigas Attini (CURRIE et al., 1999a, 2001), o fungo Escovopsis sp. explora diretamente o cultivo das formigas secretando compostos que degradam a parede das hifas/micélio do fungo mutualista e absorvendo os nutrientes liberados (REYNOLDS; CURRIE, 2004).

Apesar da alta virulência em colônias de formigas Attini verificada por Currie et al.

(1999a), análises moleculares recentes e evidências experimentais revelaram pouca especificidade entre o parasita Escovopsis sp. e as formigas-cortadeiras Atta e Acromyrmex (TAERUM et al., 2007).

Até o momento duas espécies do gênero estão descritas: E. weberi (MUCHOVEJ;



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